废水监测检测方法

检测方法概述

多种检测方法和实验室工作流程被用来量化美国各地废水中的SARS-CoV-2。实验室对照可以通过解释方法性能和数据质量来确保结果的可比性。根据废水中的SARS-CoV-2水平，可以按需要调整方法以适应更高或更低的检测极限。例如，如果废水中的SARS-CoV-2 RNA水平足够高，则可以在不进行额外浓缩过程的情况下对少量废水（例如1毫升）进行检测。检测方法包括样本处理步骤、实验室对照的使用和生物安全措施的实施，以确保数据能够被解读以供公共卫生使用。

SARS-CoV-2废水样本处理和检测概述

样本采集后，SARS-CoV-2废水检测的第一步是样本制备。在此步骤中，应在样本中加入基质回收对照。第二步是样本浓度。第三步是从浓缩废水样本中提取RNA。最后一步是RNA测量。除了在这一步中测量SARS-CoV-2 RNA外，还应该测量几个实验室对照，包括基质回收对照、人类粪便标准化、定量测量对照和评估分子方法抑制的对照。

样本处理

测定废水中SARS-CoV-2 RNA的样本处理涉及样本准备、样本浓缩、RNA提取以及RNA测量方法。废水是一种化学性和生物性复杂且多变的混合物，每个步骤所采取的的方法必须适用于废水。通过相应的实验室对照评估这些废水样本处理程序的性能。处理可能含有SARS-CoV-2的废水样本时，应遵守相应的生物安全规程，该规程如下所述。

样本制备

正确储存和准备废水样本有助于确保SARS-CoV-2 RNA废水测量的准确性。

• 储存：样本采集后立即在4°C下冷藏，如果可能，应在24小时内处理，以减少SARS-CoV-2 RNA降解，增加监测效用。如果无法在采集后24小时内处理样本，则应在4°C冷藏或-20°C或-70°C冷冻之前在样本中加入基质回收对照物。
• 均质化：在去除部分收集的废水用于下游处理之前，应将液体废水和原始污泥样本混合均匀。将样本翻转几次（对于液体样本）或通过机械进行混合。均质化的样本还可以包括分解废水中的固体和分解病毒颗粒的程序，例如通过超声处理。
• 样本净化：如果样本将用于样本浓缩，通过移除大型固体而对液体废水样本进行净化，将有利于随后的过滤浓缩步骤。然而，移除固体物也会移除附着在它们身上的SARS-CoV-2 RNA。您可以使用大孔径过滤器（5 µm 或以上）或离心方法净化样本。

样本浓度

浓缩废水样品可以提高对SARS-CoV-2 RNA的检测。浓度对于未经处理的废水样本可能比初级污泥样本更重要。有关选择样本类型的更多信息，请参见“制定废水采样策略”下的采样内容 。

目前评估的可为废水中SARS-CoV-2检测提供足够回收率的浓缩方法包括：

• 超滤
• 通过负电性膜过滤，并通过添加MgCl₂或酸化进行样本预处理
• 聚乙二醇（PEG）沉淀
• 脱脂奶絮凝
• 超速离心

选择病毒浓缩方法时，请考虑以下因素：

• 样本类型：对于未经处理的废水样本，可以使用上面列出的几种过滤和沉淀方法。对于初级污泥样本，离心是浓缩固体的最有效方法。
• 样本体积：较大的未处理废水样本体积可能要求在膜过滤前（因为过滤速度慢）或PEG沉淀前（因为离心体积限制）细分样本。大于5升的样本体积可能被要求进行适用于浓缩大体积样本的预浓缩，例如大型超滤桶。
• 潜在的供应链问题：需要商用过滤产品的方法，如膜过滤器或超滤盒，可能比其他方法对供应链的问题更敏感。
• 样本处理时间：浓缩方法的选择将受到方法处理时间和实验室可用人员的限制。混浊废水样本的膜过滤可能需要数小时。
• 实验室设备的可用性：离心机的容量和受力能力以及膜过滤装置的可用性，也将限制方法的选择。

RNA提取

核酸的提取和纯化是从污水混合物中分离出SARS-CoV-2 RNA的必要步骤。污水是一种复杂的混合物，其中含有已知会干扰分子病毒定量方法的物质，因此在选择提取方法时应考虑以下因素：

• 选择设计用于从环境样本中提取高度纯化的核酸提取物的提取方案。商业试剂盒可用于环境样品提取。
• 使用专门用于纯化RNA的提取试剂盒或方案，包括裂解前的RNase变性剂。
• 通过将提取物等分到单独的试管中并将其保存在-70°C或更低的温度下，避免由于多次冻融循环而导致的提取RNA降解。

RNA测量

检测方法：使用RT-qPCR（逆转录定量聚合酶链反应）或RT-ddPCR（RT-droplet数字PCR；其他形式的数字PCR也是可行的，但不太常见）来定量废水中的SARS-CoV-2 RNA。每种方法都可以作为1步反应（其中RT和PCR在同一反应混合物中进行）或2步反应（其中RT和PCR在单独的顺序反应中进行）进行。1步RT-ddPCR协议对废水是有利的，因为RT在单个液滴中进行，与在2步处理和RT-qPCR中本体溶液中的RT相比，它可以减少RT抑制。

遗传靶标：据报告，SARS-COV-2 N（N1和N2，CDC发表）和E基因（E sarbeco, Corman et al.，2020 EuroSurveillance）的引物和探针靶向区对污水中SARS-COV-2 RNA的定量具有敏感性和特异性。如果可能的话，使用相同的目标基因来比较废水的测量结果。

实验室对照

实验室对照对于比较一段时间内和不同废水来源的SARS-CoV-2 RNA废水浓度至关重要，特别是当使用不同的检测方法时。CDC建议对SARS-CoV-2污水监测采用以下类型的测量实验室对照：

• 基质回收对照
• 人类粪便标准化
• 定量测量对照
• 抑制作用评估
• 阴性对照

基质回收对照

使用基质回收对照（也称为过程对照）来了解样本处理过程中损失的病毒数量。该对照对于比较不同检测方法和不同时间的浓度非常重要。定量评估回收率非常重要，因为废水在化学和生物方面复杂多变，而且经常含有会干扰样本浓度、核酸提取或分子定量方法的成分。必须在方法验证中包括基质回收对照，如果可能的话，在每个样本中包含基质回收对照物，以说明废水成分的意外变化。当废水条件（例如来自雨水流入）或实验室方法发生变化时，始终包括基质回收对照。

生物学上更类似于SARS-CoV-2的基质回收对照可更准确地代表SARS-CoV-2从废水样本的回收。进行基质回收对照的候选病毒是带有单链RNA基因组的包膜病毒，包括鼠冠状病毒（也称为鼠肝炎病毒）、牛冠状病毒和牛呼吸道合胞病毒。

人类粪便标准化

 计算趋势前标准化SARS-CoV-2废水浓度，以说明随时间而产生的废水稀释变化以及相关人类废物输入差异。如果污水流域中的人数预计会在监测期间（由于旅游业、工作日通勤者、临时工作人员等）出现变化，采用废水中的人类粪便量标准化SARS-CoV-2浓度可能对于解读SARS-CoV-2浓度并对比不同时间的污水样本浓度有着重要作用。人类粪便正化对照适用于废水中可以测量的人类粪便有机物或复合物，以预估人类粪便含量。

人类粪便标准化对照包括但不限于：

• 粪便指示物病毒分子靶标：胡椒轻斑驳病毒、crAssage
• 粪便指示物细菌分子靶标：拟杆菌 HF183，毛螺菌科 Lachno3

使用人类粪便对照对SARS-CoV-2浓度进行标准化（例如SARS-CoV-2与人类粪便对照浓度之比）还可以解释在粪便输入废水系统和实验室定量之间的任何地方发生的病毒损失。但是，人类粪便标准化不能替代用于方法性能评估的基质回收对照。

定量测量对照

必须包括所有SARS-CoV-2 RNA定量方法的定量测量对照。对于RT-qPCR，从已知浓度的对照中获得校准曲线。对于RT-ddPCR，每台仪器运行时都应包括一个已知数量的对照。对于精确的RNA靶标定量，RNA对照优于DNA对照。等分定量测量对照，以避免冻融循环并将其保存在-70°C或更低的温度下。

抑制作用评估

使用抑制测试来确定RNA定量过程（RT和PCR）是否按预期执行。废水是一种复杂且可变的混合物，通常含有会干扰RNA定量方法而妨碍准确测量的化合物。

可以使用几种方法评估抑制作用：

• 当SARS-CoV-2 RNA浓度高时，通过评估稀释到不同水平的提取RNA中测得的浓度是否与预期稀释度成比例来评估抑制作用。该方法是首选，因为它可以直接评估在SARS-CoV-2定量样本中相同反应下的抑制作用。
• 当SARS-CoV-2 RNA浓度过低而无法稀释后定量时，通过将病毒RNA（例如合成SARS-CoV-2 RNA或来自非人类冠状病毒的纯化RNA，如基质回收对照中所述）加入废水提取物中，然后将测得的浓度与掺入分子阴性（无模板对照）的病毒RNA或掺入提取物的稀释液进行比较，来评估抑制作用。

如果遇到抑制作用，通常可以通过稀释提取物来消除。如果经常遇到抑制作用，则进一步优化样本处理或定量方法。

阴性对照

提取空白样本是通过提取无需添加废水样本的RNA而制成的。这些对照用于检测提取试剂的污染。将它们包含在每组提取的样本中。

"无模板对照”及没有添加废水样本核酸提取物的分子反应试剂。使用这些对照对分子试剂污染进行检测，并将其包括在所有PCR仪器运行中。

生物安全

来自废水的SARS-CoV-2浓缩要求生物气溶胶生成程序。CDC建议在具备无方向气流条件和BSL-3预防措施（包括呼吸保护和穿脱个人防护用品的指定区域）的2级生物安全（BSL2）设施中进行这些程序。来自废水样本的实验室废物可能含有SARS-CoV-2，应经过高压蒸汽处理并根据BSL2生物安全指导方针进行管理。

巴氏杀菌

已经对废水样本进行了高温巴氏杀菌，以减少废水样本处理过程中产生生物气溶胶的生物安全风险。在决定是否使用巴氏灭菌法时，请考虑以下几点：

• 在废水中，高温巴氏杀菌对PCR所针对的短RNA片段的损害程度尚不清楚。
• 同行评议报告发现，在56ºC下对呼吸道标本进行30分钟的热处理对RNA测量结果的影响可忽略不计。
• 一些研究人员报告说，在60ºC下对废水进行热处理可以改善SARS-CoV-2 RNA的测量，但需要更多的数据来确认这种效果。