Các phương thức kiểm nghiệm giám sát nước thải

Tổng quan các phương thức kiểm nghiệm

Có nhiều phương thức kiểm nghiệm và quy trình phòng thí nghiệm được dùng để định lượng SARS-CoV-2 trong nước thải ở khắp Hoa Kỳ. Các biện pháp kiểm soát tại phòng thí nghiệm có thể đảm bảo kết quả có thể so sánh được bằng cách tính đến hiệu suất của phương thức và chất lượng dữ liệu. Dựa vào mức độ SARS-CoV-2 trong nước thải, các phương thức có thể được điều chỉnh lên giới hạn phát hiện cao hơn hoặc thấp hơn khi cần thiết. Ví dụ, nếu mức SARS-CoV-2 RNA đủ cao trong nước thải, một lượng nhỏ nước thải (vd. 1 ml) có thể được kiểm nghiệm mà không cần xử lý cô đặc thêm. Các phương thức kiểm nghiệm bao gồm các bước xử lý mẫu, việc sử dụng các biện pháp kiểm soát của phòng thí nghiệm và triển khai các biện pháp an toàn sinh học nhằm đảm bảo rằng dữ liệu có thể được minh giải để sử dụng cho y tế công cộng.

Tổng quan về việc kiểm nghiệm và xử lý mẫu nước thải về SARS-CoV-2

Sau khi thu gom mẫu, bước đầu tiên của khâu kiểm nghiệm nước thải SARS-CoV-2 là chuẩn bị mẫu. Kiểm soát khôi phục ma trận nên được lồng ghép vào mẫu trong bước này. Bước thứ hai là cô đặc mẫu. Bước thứ ba là chiết xuất RNA từ mẫu nước thải đã cô đặc. Bước cuối cùng là đo RNA. Cùng với việc đo SARS-CoV-2 RNA ở bước này, một số biện pháp kiểm soát tại phòng thí nghiệm cũng sẽ được đo lường bao gồm kiểm soát khôi phục ma trận, chuẩn hóa hàm lượng phân người, kiểm soát đo lường định lượng và các biện pháp kiểm soát để đánh giá ức chế của phương thức phân tử.

Xử lý mẫu

Xử lý mẫu để đo lường SARS-CoV-2 RNA trong nước thải liên quan tới việc chuẩn bị mẫu, cô đặc mẫu, chiết xuất RNA và các phương thức đo RNA. Các phương thức được lựa chọn tại mỗi bước phải được điều chỉnh để sử dụng với nước thải, vốn là một hỗn hợp biến đổi và phức tạp về mặt hóa chất và sinh học. Đánh giá hiệu suất của các quy trình xử lý mẫu nước thải này bằng các biện pháp kiểm soát phòng thí nghiệm phù hợp. Các giao thức an toàn sinh học phù hợp để xử lý các mẫu nước thải có thể chứa SARS-CoV-2 nên được tuân theo và được mô tả sau trên trang web này.

Chuẩn bị mẫu

Việc bảo quản và chuẩn bị thích hợp các mẫu nước thải giúp đảm bảo việc đo lường SARS-CoV-2 RNA trong nước thải được chính xác.

• Bảo quản: Làm lạnh các mẫu ở nhiệt độ 4°C ngay sau khi thu gom và nếu có thể hãy xử lý chúng trong vòng 24 giờ để giảm tình trạng xuống cấp của SARS-CoV-2 RNA và tăng cường tiện ích giám sát. Nếu không thể xử lý mẫu trong vòng 24 giờ sau khi thu gom, quý vị nên lồng ghép biện pháp kiểm soát khôi phục ma trận vào mẫu trước khi làm lạnh mẫu ở nhiệt độ 4°C hoặc đông lạnh mẫu ở nhiệt độ -20°C hoặc -70°C.
• Đồng nhất hóa: Cả các mẫu nước thải lỏng và bùn thải sơ cấp nên được trộn đều với nhau trước khi loại bỏ các phần nước thải thu gom được để xử lý ở hạ nguồn. Hòa trộn bằng cách đảo mẫu vài lần (với các mẫu chất lỏng) hoặc bằng cách hòa trộn cơ học. Việc đồng nhất hóa các mẫu cũng có thể bao gồm các quy trình phá bỏ các chất rắn trong nước thải và phân tách các phần tử vi-rút, như bằng cách sóng siêu âm.
• Làm trong mẫu: Làm trong mẫu nước thải lỏng bằng cách loại bỏ các chất rắn lớn có thể hỗ trợ các bước cô đặc dựa vào thao tác lọc sau đó nếu chúng được dùng để cô đặc mẫu. Tuy nhiên việc loại bỏ chất rắn cũng sẽ loại bỏ SARS-CoV-2 RNA gắn với các vật chất rắn đó. Quý vị có thể làm trong mẫu bằng cách dùng các bộ lọc có kích thước lỗ lớn (5 µm trở lên) hoặc quay ly tâm.

Cô đặc mẫu

Cô đặc mẫu nước thải có thể cải thiện khả năng phát hiện SARS-CoV-2 RNA. Việc cô đặc có thể quan trọng đối với các mẫu nước thải chưa qua xử lý hơn là các mẫu bùn thải sơ cấp. Xem phần Lấy mẫu gì dưới mục 'Phát triển chiến lược lấy mẫu giám sát nước thải' để biết thêm thông tin về việc lựa chọn loại mẫu.

Các biện pháp cô đặc đánh giá tới nay có thể thu được khả năng khôi phục đủ để phát hiện SARS-CoV-2 trong nước thải bao gồm:

• Siêu lọc
• Lọc qua màng lọc điện tích âm cùng với việc tiền xử lý bằng cách thêm MgCl₂ hoặc a-xít hoá
• Kết tủa polyethylene glycol (PEG)
• Keo tụ sữa gầy
• Siêu ly tâm

Cân nhắc các yếu tố sau khi chọn phương thức cô đặc vi-rút:

• Loại mẫu: Đối với một số mẫu nước thải chưa qua xử lý, có sẵn một số phương thức lọc và kết tủa được liệt kê ở trên. Với các mẫu bùn thải sơ cấp, quay ly tâm là cách hiệu quả nhất để thu gom vật chất rắn.
• Lượng mẫu: Một lượng lớn mẫu nước thải chưa qua xử lý có thể đòi hỏi chia nhỏ mẫu trước khi lọc qua màng lọc (do tốc độ lọc chậm) hoặc kết tủa PEG (do hạn chế lượng máy quay ly tâm). Lượng mẫu trên 5 L có thể cần cô đặc trước bằng các biện pháp được phát triển để cô đặc lượng lớn, như siêu lọc hộp lớn.
• Các vấn đề có thể có với chuỗi cung ứng: Các phương thức đòi hỏi các sản phẩm lọc thương mại như bộ lọc có màng lọc hoặc hộp siêu lọc có thể nhạy cảm đối với các vấn đề của chuỗi cung ứng hơn là các phương thức khác.
• Thời gian xử lý mẫu: Việc lựa chọn phương thức cô đặc sẽ bị hạn chế bởi thời gian xử lý của phương thức và tình trạng khả dụng về nhân sự phòng thí nghiệm. Lọc qua màng lọc các mẫu nước thải đục có thể mất vài tiếng đồng hồ.
• Tình trạng khả dụng của thiết bị phòng thí nghiệm: Khối lượng và công suất máy quay ly tâm cùng với tình trạng khả dụng của bộ lọc màng lọc cũng sẽ hạn chế việc lựa chọn phương thức.

Chiết xuất RNA

Chiết xuất và tinh lọc axit nucleic là bước thiết yếu trong việc phân lập SARS-CoV-2 RNA từ hỗn hợp nước thải. Nước thải là một hỗn hợp phức tạp chứa các vật chất được biết là có thể ảnh hưởng tới các biện pháp định lượng vi-rút phân tử, vì vậy quý vị hãy cân nhắc các vấn đề sau khi lựa chọn một phương thức chiết xuất:

• Chọn một giao thức chiết xuất được phát triển để tạo ra chiết xuất axít nucleic có độ tinh lọc cao từ các mẫu ngoài môi trường. Ngoài thị trường có bán sẵn các bộ công cụ để chiết xuất mẫu lấy ngoài môi trường.
• Sử dụng bộ công cụ chiết xuất hoặc giao thức được phát triển riêng để tinh lọc RNA và có bao gồm chất biến tính RNA trước khi ly giải.
• Tránh làm biến chất RNA đã chiết xuất vì nhiều chu kỳ đông lạnh-rã đông bằng cách chia nhỏ chiết xuất vào các ống riêng và bảo quản chúng ở nhiệt độ từ -70°C trở xuống.

Đo RNA

Các phương thức phát hiện: Định lượng SARS-CoV-2 RNA trong nước thải bằng RT-qPCR (phản ứng chuỗi trùng hợp phiên mã ngược) hoặc RT-ddPCR (PCR kỹ thuật số giọt RT; các dạng PCR kỹ thuật số khác cũng có thể thực hiện được nhưng ít phổ biến hơn). Mỗi phương thức có thể thực hiện làm phản ứng 1 bước, trong đó RT và PCR xuất hiện trong cùng một hỗn hợp phản ứng, hoặc phản ứng 2 bước, trong đó RT và PCR và được thực hiện trong các phản ứng tuần tự, riêng biệt. Giao thức RT-ddPCR 1 bước có lợi đối với nước thải vì RT được thực hiện trong có giọt riêng, có thể giảm ức chế RT so với RT trong dung dịch có số lượng lớn, như trong quy trình 2 bước và trong RT-qPCR.

Mục tiêu gen: Chất mồi và thăm dò hướng tới các khu vực SARS-COV-2 N (N1 và N2, được CDC công bố) và gen E (E_sarbeco, Corman và đồng nghiệp, 2020 EuroSurveillance) đã được báo cáo là nhạy và đặc hiệu cho việc định lượng SARS-CoV-2 RNA trong nước thải. Khi có thể, hãy so sánh các số đo nước thải bằng cùng các gen đích.

Kiểm soát phòng thí nghiệm

Các biện pháp kiểm soát của phòng thí nghiệm đặc biệt quan trọng để so sánh nồng độ SARS-CoV-2 RNA trong nước thải qua thời gian và giữa các nguồn nước thải, đặc biệt là khi quý vị dùng các biện pháp xét nghiệm khác nhau. CDC khuyến nghị các loại kiểm soát đo lường của phòng thí nghiệm đối với việc giám sát  SARS-CoV-2 trong nước thải như sau:

• Kiểm soát phục hồi ma trận
• Chuẩn hóa hàm lượng phân người
• Kiểm soát đo lường định lượng
• Đánh giá ức chế
• Kiểm soát âm

Kiểm soát khôi phục ma trận

Dùng kiểm soát khôi phục ma trận (còn gọi là kiểm soát  quy trình) để hiểu lượng vi-rút tổn thất trong quá trình xử lý mẫu. Biện pháp kiểm soát này quan trọng trong việc so sánh nồng độ từ các phương thức kiểm nghiệm khác nhau và theo thời gian. Điều quan trọng là đánh giá định lượng mức khôi phục vì nước thải là loại biến đổi và phức tạp về mặt hóa chất và sinh học, thường chứa các thành phần có thể tác động tới nồng độ của mẫu, chiết xuất axít nucleic hoặc các phương thức định lượng phân tử.  Quý vị phải bao gồm biện pháp khôi phục ma trận trong việc xác thực phương thức và, nếu có thể, bao gồm biện pháp với mỗi mẫu để tính đến những thay đổi ngoài dự kiến trong thành phần nước thải. Luôn bao gồm biện pháp kiểm soát khôi phục ma trận khi điều kiện nước thải (như lưu lượng vào từ nước mưa) hoặc các phương thức  phòng thí nghiệm thay đổi.

Biện pháp kiểm soát khôi phục ma trận, tương tự về mặt sinh học hơn với SARS-CoV-2, có thể thể hiện chính xác hơn khả năng khôi phục SARS-CoV-2 từ một mẫu nước thải. Các ứng viên của biện pháp kiểm soát khôi phục ma trận là các vi-rút được bao bọc bởi bộ gen RNA sợi đơn, bao gồm vi-rút corona murine (còn gọi là vi-rút viêm gan murine), vi-rút corona ở động vật nhai lại và vi-rút hợp bào hô hấp ở động vật nhai lại.

Chuẩn hóa hàm lượng phân người

Việc chuẩn hóa nồng độ SARS-CoV-2 trong nước thải trước khi  tính toán xu hướng được thực hiện để tính đến những thay đổi về độ pha loãng nước thải và sự khác biệt trong đầu vào tương đối của chất thải con người theo thời gian. Nếu số người đóng góp vào hệ thống thoát nước dự kiến sẽ thay đổi trong thời gian giám sát (do ngành du lịch, người đi làm trong tuần, công nhân tạm thời, v.v.), thì việc chuẩn hóa nồng độ SARS-CoV-2 qua lượng phân người trong nước thải có thể quan trọng đối với việc minh giải nồng độ SARS-CoV-2 và so sánh nồng độ giữa các mẫu nước thải theo thời gian. Các biện pháp kiểm soát chuẩn hóa hàm lượng phân người là các sinh vật hoặc hợp chất đặc trưng cho phân người có thể đo được trong nước thải để ước tính hàm lượng phân người.

Các biện pháp kiểm soát chuẩn hóa hàm lượng phân người bao gồm nhưng không giới hạn đối với:

• Mục tiêu phân tử của vi-rút chỉ thị phân: vi-rút Pepper Mild Mottle, crAssphage
• Mục tiêu phân tử của vi khuẩn chỉ thị phân: Chất diệt khuẩn HF183, Lachnospiraceae Lachno3

Chuẩn hóa nồng độ SARS-CoV-2 bằng các biện pháp kiểm soát lượng phân người (vd. tỉ suất SARS-CoV-2 với nồng độ kiểm soát hàm lượng phân người) cũng có thể có vai trò trong việc thất thoát vi-rút xảy ra bất cứ đâu giữa các điểm chuyển phân vào hệ thống nước thải và định lượng tại phòng thí nghiệm. Tuy nhiên việc chuẩn hóa phân người không thể thay thế các biện pháp kiểm soát khôi phục ma thuật cho việc đánh giá hiệu suất của phương thức.

Kiểm soát đo lường định lượng

Bạn phải đưa các biện pháp kiểm soát đo lường định lượng vào tất cả các phương thức định lượng SARS-CoV-2 RNA. Đối với RT-qPCR, lập đường cong hiệu chỉnh từ biện pháp kiểm soát nồng độ đã biết. Đối với RT-ddPCR, bao gồm biện pháp kiểm soát số lượng đã biết với mỗi lần chạy thiết bị. Biện pháp kiểm soát RNA được ưa thích hơn so với biện pháp kiểm soát DNA để định lượng đích RNA chính xác. Chia nhỏ biện pháp kiểm soát đo lường định lượng để tránh nhiều chu kỳ đông lạnh-rã đông và lưu trữ chúng ở nhiệt độ từ 70°C trở xuống.

Đánh giá ức chế

Dùng xét nghiệm ức chế để xác định liệu các quy trình định lượng RNA (RT và PCR) có thực hiện như dự kiến không. Nước thải là một hỗn hợp phức hợp, biến đổi và thường chứa các hợp chất có thể cản trở việc đo lường chính xác qua việc tác động tới các phương thức định lượng RNA.

Có thể đánh giá sự ức chế bằng nhiều phương thức khác nhau.

• Khi nồng độ SARS-CoV-2 RNA cao, hãy đánh giá sự ức chế bằng cách đánh giá liệu nồng độ đo được trong RNA được chiết xuất được hòa tan theo các mức khác nhau được chia tỷ lệ với độ pha loãng như dự kiến. Phương thức này được ưu tiên vì nó cho phép đánh giá trực tiếp sự ức chế trong cùng phản ứng dùng để định lượng SARS-CoV-2 trong mẫu.
• Khi nồng độ SARS-CoV-2 RNA quá thấp để định lượng sau khi pha loãng, hãy đánh giá ức chế bằng cách đưa RNA vi-rút (vd, SARS-CoV-2 RNA tổng hợp hoặc RNA được tinh lọc từ vi-rút corona không phải của con người như mô tả trong biện pháp Kiểm soát khôi phục ma trận) vào trong chiết xuất nước thải và so sánh nồng độ đã đo với RNA vi-rút đã đưa vào trong phân tử âm (không có biện pháp kiểm soát mẫu) hoặc với phần pha loãng chiết xuất đã đưa vào.

Nếu thấy có ức chế, tình trạng này thường được loại bỏ bằng cách pha loãng chiết xuất. Nếu quý vị thường thấy có ức chế, hãy tối ưu hóa thêm việc xử lý mẫu hoặc các phương thức định lượng.

Kiểm soát âm

Khoảng trống chiết xuất được tạo ra bằng cách chiết xuất RNA mà không cho thêm mẫu nước thải. Những biện pháp kiểm soát này được dùng để phát hiện nhiễm bẩn thuốc thử chiết xuất. Bao gồm chúng với mỗi bộ mẫu được chiết xuất.

"Không có biện pháp kiểm soát mẫu" là thuốc thử phản ứng phân tử mà không có thêm chiết xuất axít nucleic của mẫu nước thải. Dùng các biện pháp kiểm soát này để phát hiện tình trạng nhiễm bẩn thuốc thử phân tử và bao gồm chúng với tất cả các lần chạy thiết bị PCR.

An toàn sinh học

Nồng độ của SARS-CoV-2 từ nước thải đòi hỏi các quy trình tạo khí dung sinh học. CDC khuyến nghị tiến hành các quy trình này ở một cơ sở có mức an toàn sinh học 2 (BSL2) và có luồng không khí một hướng và biện pháp phòng ngừa BSL-3, bao gồm việc bảo vệ hệ hô hấp và khu vực riêng để đeo và cởi thiết bị bảo hộ cá nhân. Chất thải phòng thí nghiệm từ các mẫu nước thải có thể chứa SARS-CoV-2 phải được hấp tiệt trùng và quản lý theo các hướng dẫn an toàn sinh học BSL2.

Tiệt trùng

Tiệt trùng bằng nhiệt các mẫu nước thải đã được tiến hành để giảm nguy cơ an toàn sinh học từ các quy trình tạo khí dung sinh học trong khi xử lý mẫu nước thải. Cân nhắc mục sau khi quyết định liệu có bao gồm việc tiệt trùng hay không:

• Mức độ theo đó việc tiệt trùng nhiệt sẽ làm hỏng các phân đoạn RNA ngắn mà PCR nhắm tới hiện vẫn chưa xác định trong nước thải.
• Các báo cáo được đồng nghiệp đánh giá đã phát hiện thấy rằng việc xử lý nhiệt các mẫu xét nghiệm hô hấp ở nhiệt độ 56ºC trong 30 phút gây ra thay đổi không đáng kể đối với số đo RNA.
• Một số nhà nghiên cứu đã báo cáo rằng việc xử lý nhiệt nước thải ở nhiệt độ 60ºC có thể cải thiện số đo SARS-CoV-2 RNA, nhưng vẫn cần thêm dữ liệu để xác nhận tác động này.