339 TRANSFORMATIONS ALLOGkNES DU PNEUMOCOQUE HARRIETT EPHRUSSI-TAYLOR avec la collaboration technique de Mme. L. G 0 L D STE I K Inscitut de G&%que du C. N. R. S. et Institut de Biologie PhIsico-Chimique, Paris, Frunce Reru le 3 F&&r, 1951 Loasoc*os fait agir, dans dcs conditions yui seront rappel&s plus bas, an estrait dc pncun~ocoqucs B capsule sur une culture dc pncumocoques sans capsule, on y induit l'apparition dc bactEries semblablcs ZI celles de la souche utilisCe pour la prdparation de l'extrait, Ces espCriences, rCalisCes par Griffith (4) et Avery, MacLeod et McCarty (l), montrent que chaque type de pncumocoque h capsule renferme un agent responsable de la for- mation et de la sp@cificitC du polysaccharidc capsulaire. L'Ctude chimique de ces agents (t( transforming p rinciples )) ou (( Tl' )) de Avery) indique qa'ils sont conipos@s uniquemcnt d'acide desos~ribonucl~iqile (ADS). Leurs proprEt& biologiqucs sugghrent d'autrc part qu'ils rcprkntent dcs unit& $nCtiqucs, r-ponsables dc lcur propre propagation dans la bactontanCc. Nous alyons &tudi& l'agglutination, par les anticorps du Type III, de wuvicnt quC la transformation dcs sou~hcs Sill-2 n'a jamais pu Ctre elfcc- l&e (14, 15). Par conskluent, un test direct de l'acti\-it@ transformante deux clones, SIlI-2a et SIII-2h provenant de transformations allo@nes. et (1~ ]a s0~cllc SIlI-~ originale. I,cs Gsultats dcs titrations tl'agglutinatiol: &I Tl' Sill-2a SUI' des pncumocoqucs Slll-2 n'a pas pu etrc fait. -1)~s es- Cences de transformation ;I l'aide tic ce TP de ba&rics de la classe Sill-1 donn& clans 1~ tableau \' indiquent quc lcs trois SOuChes `ComparkCs secrc- tent apl"oximati\-emcnt la mCme quantitf. de pol~saccharide cal)sulairr. montrent que le Tl' Slll-2a difke du ?`I' SIII-2. Le TP Slll-2 induit dans `Mes les IignPes ti ph@notvpe Slll-1 h la fois des transformations allo@nes Aucunc de ces souches n'cst a gglutinCe par un immunserum an~irou@. et autogtillcs. I Or, commc le monk le tableau \`I, le TP Slll-2a n'induit 600 H. Ephrussi-Taylor des transformations allogitnes que dans la souche SIII-lc. Dans toutes lcs autres, son activite se borne aux transformations autogcnes. Ainsi, le TP SIII-2a est distinct du TP SIII-2 et on peut se demander si ses propriCtCs ne reflctent pas son origine. La 1ignCe SIII-2a provienl d'une transformation de la souche SIII-la par le TP SIII-1. cOntiendrait- elle les TP de ces deux lignCes? Ceci ne nous parait pas trEs probable pour lcs raisons suivantes: 1) En agissant sur la 1ignCe R36A, le TP SW-2a induit l'apparition &, bactCries SIII-2 arec une fkquence relativement grandc. Or, s'il ctait ,,,I melange des TP SIII-1 et SIII-la, 1~s transformations en SIlI-2 tlevraienl etre extrdmement rarcs, car elles requerraient l'interrention simultance (lr ces deux TP. 2) De mtme, en agissant sur les lignees SIII-1, SIII-la et SIII-lb, cE TP induit constamment des transformations en S111-2. Or; si le TP Sill-2 Ptait un melange des TP SIII-1 ct SIII-la, ccs transformations devraient &tre t&s pares, comme toutcs les transformations allogknes en SIII-2. 3) En agissant sur la 1ignCe SIII-1~. le TP SIII-2a induit constammenl des transformations en SIII-2 et SIII-S. Or, si cet agent dtait un m6lange dck TP SIII-1 et SIII-la, un tel r&&at serait trk improbable; chacun & ccs TP, lorsqu'ils agissent sur SIII-lc, induiscnt en effet des transformations en SIII-N. On s'attendrait done plut6t ti ce qu'un mClangc des TP SIII-1 et SIII-la induise Cgalement des transformations en SIII-N lorsqu'il agit sur SIII-lc. 11 paraPt par con&quent plus probable qu'au tours de la transformation qui a donnC naissance B la souche SIII-2a, il s'est form6 un nouvel agent transformant (SIII-2a). IV.-Nature de la transformation allog?ne en SZZZ-N. La formation, dans certaines transformations allogitnes, de bactkries ZI phkotype SIII-N, pose des probknes tout 5 fait analogues h ceux posk par l'origine de la souchc SIII-2a. Ici encore le phbnotppe SIII-N pourrait dtre dG soit h ce que les bactdries SIII-S renferment deus TP mutCs dont l'action cornbinGe rCtablil la s&c&ion normale de polysaccharide, soit j ce qu'un agent capsulaire SIII-N a PtE reconstituC j partir de deux agents mutCs. Quoique la premiiire hypothkse paraisse peu probable g la suite de 1'Ctude de l'agent SIII-2a, nous avons, h titre de v-Crifkation, i-tudiC l'agent capsulaire d'une 1ignCc SIII-s rCsultant d'une transformation alloghne. Une 1ignCe SIII-S apparue dans unc expkicnce de transformation de la souche SIII-la par l'agent transformant SIII-2 a CtC choisie pour cette Ctude. Transformations du Pneumocoque 601 cc choix a t% gouvern@ par les considfirations suivantes. Les bactkies ~111-2 forment des colonies trEs nettement distinctes des colonies R ou sill-1. Par consCquent, la prCsence de l'agent SIII-2 dans l'acide nuclCique 1 de la souche allogke SIII-N serait facilement dCcelee sans l'application I 1 ,le techniques spkiales. i lln clone de bactCrie SIII-la a CtC trait6 par le TP SIII-2. Comme tou- jOINs cc traitement a abouti B la formation de pneumocoques SIII-2 et sill-S. Une colonie SIII-N a 6tC isolCe et a fond6 le clone qui a servi B risolcment de l'acidc d&soxyribonucl&que. L'activitf: transformante de cette dubstallcC a btd test& sur les souchcs R36A et SIII-1. Des pneumocoques 911-2 nc sont apparues dans aucun cas. La pr@paration utilisee s'est done comportee comme toute prhparation obtenue B partir de pneumocoques SllI-N. Elle parait par consCquent rcnfermer seulement un agent trans- ' formant capsulaire normal. I tinsi, les rkultats de nps expkienccs suggkent que les transformations a]log&nes resultent de la reconstitution d'un agent capsulaire normal ou I mutC 5 partir de deux agents capsulaires mu& ditXrents, le degrC de re- constitution dEpendant. des propriCt& spkifiques des deux agents qui ont participh b la reconstitution. DISCUSSION On sait que la reduction de la capsule chez certains mutants du pneu- mocoque cst le resultat de la mutation sponta&e de l'agent capsulaire (TP) qu'ils contiennent (10, 14, 15). Xous venons de montrer que, lors- que des pneumocoques qui contiennent un TP mulC sont trait& par un TP mute diffkent, on,observe des transformations allogGnes, c'est-i-dire l'ap- parition de bactkies B synthcse capsulaire entiPrement ou partiellement rC- tablie, selon la paire de TP confront&. Les expkriences qui viennent d'ttre d&rites montrent que cette restitution intbresse non seulement le phCnot!-pe de la bactkie, mais aussi son TP. Ainsi, lorsqu'une transformation allo- : $ne aboutit j la synthke capsulaire normale, on trouve dans la bac- j lkie un TP normal. Lorsque, au contraire, elle a pour resultat la res- titution partielle de la synthtke capsulaire, on trouve dans la bactCrie un TP nouveau, qui ne peut induire dans une bactCrie << rough 1) que la forma- tion d'une capsule rEduite. Autrement dit, tout se passe comme si le TP de la bactkrie mutCe Ctait plus ou moins (( normalisf: H sous l'action du TP, ' @lement mute, introduit dans le milieu. Quelle que soit la paire de TP I dormant naissance g un TP normal, sa formation est un CvCnement relatire- 602 H. Ephrussi-Taylor Translorma Lions du Pneumocoque 603 mcnt frcqucnt. La formation tl'un TP particllemcnt restituc est, au COlltrairr, un cvcnemcnt rare.- Les transformations allogcnes resscmblent incontestablement aux rccon,. ljinaisons d&rites chcz lrs bacteriophages et le virus de l'inlluenza (2, J, 5, G, S, 9). Ces rccombinaisons ont lieu quand unc cellulc cst infect~t, simultancmcnt par deus virus diffcrcnts, mais ctroitement apparcntcs. lc,, fait, lc cas lc plus ctiidic est cclui d'unc scric tic bactitriopliagcs mrltcs, dcrivcs de la ligncc `I2 (5, 6). Trois sortcs de recombinaisons ont @tc r+ c011t111cs: a-l~ormation de particules de virus ayant dcs caractcrcs spdcitiques drs deux soucl~es infectantes (2, 3, 5, 6). b--Formation de virus normal a partir de deus particules de virus inac- tivcs par irradiation (8, 9). c--Formation de virus normal a partir de paircs de SOUC~WS pr6Sentant le mCmc caractcrc mutt et derant leur originc h des mutations spontanccs indcpcndantes au sein de la m6mc souche. I1 s'agit clans cc cas des muta- tions r (lye rapide des batteries infect&s) tlu hactfriophagc `1'2. Quatorrc mutants indcpcndants ont Et6 Ptudies. Une bactcric infect& par n'importe qucllc pairc de ccs mutants peut dormer un virus normal, mais la ErCqucncc des rccombinaisons depend de la pairc employee (5, 6). Lcs rccombinaisons tic ccttc dernicre sortc scmblcnt prCscntcr une ana- logic frappante avec lcs interactions cntrc TP au tours dcs transformations allogencs et il est tentant de chcrcber UIIC base commune aux deux phcno- mcncs. Dans cc qui suit, nous rccommencerons par rappclcr les hypo- theses proposces pour l'explication dcs recombinaisons choz les virus; nous esamincrons ensuitc la possibilitc d'appliquer cc's hypothcscs aux trans- formations allogitncs. Lcs hypotheses de Luria (8, 9) et de Hershey et Rotman (5, 6) ont en commun un postulat important, h savoir que le bacteriophage est compost de plusicurs elements genetiques distincts. Les autcurs cites admettent que lcs rccombinaisons obserrces dans les bactcries infect&s simultancment psr plus d'unc sortc dc phagc sont tlurs 2 dcs rcassociations tics El~1llcllts gCnE- tiqucs de dcus particulcs de virus dilkents. 1,~s rccombinaisons du type a sont expliqufes par cette thcorie sans autre hypothcse. Lcs recombinaisons du type b s'exl~liclucnt si l'on suppose quc chacune dcs tlcus particulcs irradiccs conticnt une mutation lcthalc dit% rentc. Entin, lcs rccombinaisons c s'expliqucnt si l'on admet cpe 1~ phkrlo- type r cst dG, dans chacune dcs lignccs examinces, Zr la mutation d'un locus different. I ccs hypothcscs rcsscmblrnt bcaucoup a la thcorie du crossing-over dcs chrOIllOSOlllCS dont les auteurs se sont inspires et sont plausihles surtout parcc quc lc bactcriophagc est relativcment grand et douc de proprictcs biologiqurs I ,.arifJCS: on connait ties mutations qui affcctcnt la nature de la lvsr, la capa- $4 d'ctre adsorbc par un liotc donnc, l'cxigcncc dcs factcurs acccssoirrs 1 l'cur l'atlsorption par la bactcric et la stabilitc A la chalcur. Ainsi l'hypothcsc &n iaquclle lcs l~actcriol~liagcs sont composi's de plusicurs gi*nes cadre bicn I afcc lcs conceptions actucllcs dc l'ctroitc spccificiti: des gcncs. On pcut sc dcniandcr si unc thdoric analoguc pcut rendre coniptc tlrs trsnsforniations al lo~~ncs. Ccci nc parait pas facile pour lcs raisons sui- vantCS: 1-1,~ TP capsulaircs mutes du Type III n'ont apparemmcnt qu'unc reulc activitc phcnotypique: l'induction de la synthbe plus ou mains active ' ({c l~ol~saccl~aride capsulairc du type 111. La spccilicite de la catalyse de tous ces TP cst la niBme ct il n'y a done pas de raison d'admettrc quc ragent capsulaire cst composd de plusicurs dlcnients g6nCtiques distincts. %--Pour rcntlre rompte tics tlonnccs d&rites dans cc travail par unc lheorie analoguc 2 la thcoric dc crossing-over, il strait nkessairc de postulcr au mains G gc'ncs 1iCs. Or, lcs propriitcs chimiqucs et l~li~sicocl~imiqucs connuC.5 tic l'agcnt capsulaire normal ne cadrent pas avec `unc tcllc itlce. Cornme nous l'a\-ons indiquit plus ham, cclui-ci scmblc Ctre composd uni- quement de 1'Al)S. Lcs Ctudcs lcs plus rcccntcs dc l'liistocliiniie tlrs chro- mosomes montrcnt quc ccux-ci doivrnt lcur structure a unc association des `proteincs et dcs acitles ribonucl&pics et dcsosyril~onuclCiqucs. Aucune de ces trois classes de substances nc peut Ctrc considErEe comme seulc respon- sable de la structure lincairc. D'un autre cotc, lcs extraits qui rcnferment I'agent capsulairc sont dCpourvus de toutc protcinc dkelable et ne renfcr- ment pas d'uracile, compos@ caractcristiquc de l'acidc ribonucleique (7). De plus, la nature chimique de l'agcnt transformant capsulaire est indiquce clairement par son extrknc sensibilitd R l'action de la d6sosyribonuclCase cristallisce. La ribonuclcase et la trvpsine ne l'attaquent pas. L'agcnt cap- : sulairc sc dcplacc tlans l'ultra-~cntrifilgc ct tlans l'al~l~areil de `I'isclius a\-cc I 16 lnolcciilcs d'acitlc cl~sos~rit~onucl~i~l~ic. 11 n'y a aucune indication qu'il soit compost d'autres substances quc l'acidc tlCsos~ribonucl6iquc. I1 est done difficilc de concilier les rkultats de toutes les etudes chimiquc, phy- sicochimique et biochimiquc de l'agcnt transformant awe 1'idCe qu'il cst un fragment de cl~roniosomc. II convient toutefois de remarqucr que ccs ' difficult&s peurent etre dues au fait quc nos connaissanccs chimiqucs de la I structure 1inEaire des cliromoson~cs sont fondces sur des etudes de la struc- 604 H. Ephrussi-Taylor ture microscopique. A l'khelle macromokulaire, nos connaissances des gitnes sont nulles et c'est pourquoi les spkulations sur l'identitb de l'agent capsulaire avec un ou plusieurs g&nes ne peuvent pas &tre fructueuses. On peut rendre compte des don&es relatives aux transformations allo. gitnes en admettant que les agents mu& diErent entre eux par des rEgions altCr@es lc long d'une structure 1inCaire. 11 suffit de supposer: 1. Qu'une mutation du TP consiste en une altkration localike de sa strut. ture. 2. Que l'agent capsulaire ait une polaritk 3. Que toute altkation de sa structure ait pour effct une diminution de la &r&ion de polysaccharide capsulaire. 4. Que les diffkences dans la sCcrCtion du polysaccharide soient en rapport avec 1'Ctendue de la region altCrCe. On voit alors comment la combinaison de deux fragments d'agents cap- sulaires presentant des altkrations dans des regions diWrentes peut permettre la reconstitution d'un TP normal; et comment les combinaisons de deux segments d'agents transformants h rCgions mutCes qui se chevauchent ne peuvent conduire qu'& des reconstitutions partielles. La figure 1 donne une repr@sentatio!l schCmatique de cette interprCtation. La rbgion alt6rCe de l'agent SIII-1 est placCe arbitrairement. Celle de l'ageat SIII-la est placCe de facon a chevaucher la region mutEe SIII-1, puisque l'intcraction de ces deux agents ne donne que des reconstitutions partielles. Le TP SIII-lc est repkent avec une region mutCe qui lui est particulike, parce qu'il donne des reconstitutions de l'agent normal avw les deux pre- miers. Enfin, l'agent SIII-2 est reprCsent6 avec une region mutCe plus petite et en position diffkente des pr&cCdentes, parce qu'il donne des reconstitu- tions de l'agent normal avec n'importe lequel des autres agents mu&. On notera que l'hypothitse prCsentCe rend compte d'une caractkistique saillante du TP SIII.-2a, celle notamment de ne pas donner de trans- formation Bllogiine par action sur les souches SIII-1 et SIII.-la. Le TI' SIII-2a possPde, selon notre interpretation, la rkgion mut&e commune aux aients SIII-1 et SIII-la, B l'interaction desquels il doit son origine. 11 ne peut done pas, en se recombinant avec un de ceux-ci, mener a la formation d'un TP qui ne prkente pas cette region altCrCe. Notre hypothi?se trouve en oulre un appui important dans la raret6 des transformations allogcnes qui donnent naissance g des TP tels que SIII-2a. Ces transformations exigeut en effct, selon notre schGma, des EvCnements extr&mement p&is, B savoir des recombinaisons qui Climinent les rCgions mutees particulibres h chacun Transformalions du Pneumocoque 605 Sm-2a A SE-1 - SD-tact b- 5lmc - Sm-2 c S m-N 5 m-N Sru-N S III-N SUEN Sm-N Fig. 1. Schema des agents transformants mutCs fondC SW les hypothkes dCcrites dans le teste. Les segments gris reprCsentent les rkgions alter&es par mutation spontanCe. A gauche: agents transformants. A droite: restitution maxima h partir des fragments rCunis de paires #agents mu&. 1 des TP participants. Elles doivent done &kc tr6.s rares et on a vu qu'elles le sont. ~ L'hypothPse formul@e traduit en termes gComCtriques les donnCes obte- nues avec les divers agents capsulaires mutCs. C'est peut-6tre un tort de con- struire unk image gComCtrique, parce que, si l'agent capsulaire n'est qu'une molkcule d'acide dCsoxyribonuclCique, comme on peut le penser, il est peu probable qu'une simple image g@omfkiquc d&rive l'etat r&l des chases. Mais, d'autre part, cette image suggke certaines espkienccs, telles que la recherche de pneumocoques contenant un agent h deus regions mutdes, rkultant aussi d'une transformation allo+ne et dont la dPmonstration serait un argument en faveur de l'interpr@tation proposde. Toute spkulation mise h part, il est evident que l'agent capsulaire SC comporte comme un 6lCment composC de sub-unit&. Faute de donnCes PIUS pritcises sur la nature chimique et physicochimique de l'agent capsulaire, 606 H. Ephrussi-Taylor Transformations du Pneumocoque 60'7 et dans l'ignorancc unit6 g@nctique, la tuelle. Oh II~~S SOI~WS de ce qu'est l'autoreproduction [llune blable au phCnotype appelE SIII-2, prkente dcs activitk transformantcs qui definition de ces sub-unit& est impossible B l'heure ac- lui sont particulikes et reprkente done un nouvel agent qui n'a jamais #. trouve dans la nature. R6SUM6 La structure possible de l'agent capsulairc cst discutk B la 1umiEre drs +sultats observk. Les a&i\-it& l)iologiquCs de cinq agents transformants capsulaires lnutcs LITTkRATURE CITkE du Type III ont 6th Ctudices. Ces agents apparticn~ient 2 tlCUX Cat@gorit,s: ceux (SIII-I) qui intluisent la synthke de l'antigkw capsulaire tlu ?`s,,,. 1. AVERY 0. T., MACLEOW C. hl., et nkcARTY, M., J. Expll. Med., 79, 131 (1944). IlI en quantitc insuffisante h la formation d'une capsule complete, et ceuX ' 2. RuRSET, F. hl., Trams. N. I'. Acnd. Sci., 13, 2 (1950). (SIII-2)- qui induisent la formation d'une capsule du Type III complete, mais encore de dimensions rkluites par comparaison avcc la Capsule (le pneumocoques normaux. J. DELBRiiCK, %I., et hILEY, \V. `r., Jr., Cold Spring Harbor Symposia Quanf. Viol., 11,33 (lW6). 4, GRIFFITII, F., .Z. Hyg., 27, 113 (19%). 5, HERSHEY, A. D., et ROTMAX, H., hoc. Null. Acad. Sci., 34, 89 (1948). 6. - Cenefics, 34, 44 (1949). 7. HOTCIWSS, R. D., Cdloqtces Znfcrn. du C. N. R. S., VIII, 57 (1918). 8. LURIA, S. E., Proc. Nalf. Acad. Sci.. 33, 253 (1947). g, ~ Genefics, 34, 92 (1949). Chacun de ccs agents isol& sous forme d'acide dCsoxyribonucldique in. duit, dans des bactCries sans capsule, la formation d'tine capsule idcritique h celle du pneumocoque dont l'agcnt a EtC extrait. Ces inductions, tout ;, fait analogues aux transformations classiques, bnt &ii appel@es tfansfornl~,- tions nutog2nes. On pcut confronter dcus agents mutPs dans une sculc bactcrie, puisq~e la transformation dcs pncumocoques m&s de la catbgoric SIII-1, q"i se&tent trk pcu de polysaccharide, cst encore possible. Dans ce cas, 011 observe g&Gralement l'apparition de pneumocoques dont la sythEse cap- sulaire est h la fois plus active que celle de la souche trait& et celle de la souche qui a fourni l'agent transformant. Ccs inductions ont PtC appel&es transformations alloghes. Le degrC d'augmentation dc la sgnthke capsulaire, qui r@sulte d'une trans- formation allogcne, dCpend de la pairc d'agents confront&s. Les diverscs transformations allogEnes n'ont pas lieu avec la meme facilite, certaines d'entre elles &ant t&s rares. Les transformations allogcnes sont dues ti la formation d'agents trans- formants dont l'activitC, au point de vue de la synthEse capsulaire, est accrue. Cette activitb attcint, dans certains cas, cclle des agents normaus. f L'@tudc des transformations allogPnes iAontre clue lcs mutations spontank I I et ind4pendantes de I'agcnt capsulaire normal en agciit SIII-1 ne sont pas nkessairement identiques. Parmi les quatre agents de cette catCgorie ttudiCs, trois sont diffkents. - Au win ct'unc population, un mitine agent mutC pcut induirc simultanC- ment des transformations autogEnes et allogcnes. Un nouvel agent mute, resultat d'unc transformation allogcne, a ttc identifik. Cet agent, qui confke aux pneumocoqucs un phCnotype sem- 10. MACLEOD, C. M., et I&AU&, h~ARJOIUE, J. ~zpff. Med., 86, 439 (1947). II. hfCCARTy, hf., et AVERY, 0. T., J. IErpff. Med., 83, 97 (1946). 12 MCCAHTY, bl., TAYLOR, H. I-:., 11, 177 (1946). et hwr*~, 0. T., Cold Spring Harbor Symposia Qtrunf. Uiof., 1% SEVAG, hl. C., Uiochem. Z., 273, 419 (1934). 14. TAYLOR, H. E., Collogues Znlern. du C. A'. R. S., VIII, 45 (1948). 15. - J. Expfl. Med., 89, 399 (1949).